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Dec 13, 2023

ウルトラベースの抗酸化戦略

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8455 (2023) この記事を引用

1080 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

生物体内の過剰な活性酸素種（ROS）はさまざまな病気を引き起こすため、抗酸化は生体システムで求められています。 従来の抗酸化戦略は主に外因性抗酸化物質の導入に基づいています。 しかし、抗酸化物質には通常、安定性が低く、持続可能ではなく、潜在的な毒性があるという欠点があります。 ここで我々は、超小型ナノバブル（NB）に基づく新しい抗酸化戦略を提案しました。この戦略では、気液界面を利用してROSを濃縮し、除去します。 超小型NB（約10 nm）はヒドロキシルラジカルによる広範な基質の酸化に対して強力な阻害を示すのに対し、通常のNB（約100 nm）は一部の基質に対してのみ機能することが判明しました。 超小型NBの気体と水の界面は消耗品ではないため、その抗酸化作用は持続可能であり、その効果は累積的である。これは、ガスが消耗され、反応が持続不可能であるため、反応性ナノバブルを使用してフリーラジカルを除去する方法とは異なる。 。 したがって、超小型NBに基づく当社の抗酸化戦略は、バイオサイエンスのみならず、素材、化学産業、食品産業などの他の分野においても、新たな抗酸化ソリューションを提供するものと考えられます。

活性酸素種 (ROS) は通常、正常な細胞代謝とともに持続的に生成されるため、生体システムでは抗酸化が最も懸念される問題の 1 つです 1,2。 しかし、過剰な ROS は、脂質、タンパク質、DNA 分子などのさまざまな重要な細胞成分に酸化的損傷を引き起こすことがよくあります 3、4、5、6。 現在、ROS 関連疾患を軽減するための栄養補助食品として、さまざまな抗酸化物質が提案されています 7。 これらの抗酸化物質の有効性は、多くの酸化損傷によって引き起こされる急性疾患の治療において証明されています8,9。 しかし、ここ数十年間、抗酸化物質のサプリメントによる酸化損傷によって引き起こされる慢性疾患の治療に関する臨床試験のほとんどは、臨床上の利点について説得力のある証拠を提供していません10。 残念ながら、一部の抗酸化物質には有毒な副作用さえあり 11、12、13、14、15、それらのほとんどは使用を持続できず、通常の環境に敏感なため不安定になります 16、17、18、19、20、21。 したがって、高い安定性、持続可能性、および生物学的安全性を備えた新しい抗酸化戦略が求められています。

気液界面には独特の物理的、化学的、生化学的特性があることが長い間認識されてきました。 最近では、多くの酸化/還元反応を制御するために使用されています。 いくつかのシミュレーションと実験的証拠は、気液界面が ROS を濃縮し、その生成と消光のプロセスを制御し、その結果 ROS による基質酸化反応を促進/阻害する可能性があることを示しています。 例えば、Heath と Valsaraj26 は、気液界面における ROS と反応物の濃縮プロセスを研究し、バルク溶液と比較して反応速度が数桁大幅に促進されることを発見しました。 Nam と Richard 27、28、29 は、さまざまな種類の基質の小さな水滴の気液界面で酸化または還元が起こることを発見しました。 これらの研究では、気液界面は ROS および/または基質の吸着によって影響を受けます。 したがって、気液界面の表面積が非常に小さく、ROSの濃縮を好むが、より大きな物質を収容するスペースが不十分な場合、一連の基質に対して一定の抗酸化活性を示す可能性があります。 これまでのところ、反応性に及ぼす気液界面のサイズ効果は、ナノ液滴の場合のように調査されていない 30,31。

ナノバブル (NB) は、通常、水相中に懸濁したナノスケールの気相であり 32,33、ROS の濃縮に使用できる多数の気液界面を提供できます。 NB のサイズは、約 10 nm (超小型 NB) から数百ナノメートル (通常の NB) までさまざまです。 したがって、気液界面の抗酸化または酸化を研究するのに適したモデルです。 これまでに、酸素 NB はマイクロバブルの崩壊を通じてヒドロキシル ラジカルを生成することで ROS の形成を促進し 34、還元性水素 NB は ROS のクエンチングを助けたことが報告されています 35,36。 しかし、これらの研究では、NB のサイズではなく気相の化学的特性に焦点が当てられており、ナノバブル内のガスは消費され、枯渇して酸化還元反応が持続不可能になるためです。

この研究では、外因性抗酸化物質を使用しない超小型 NB に基づく抗酸化戦略が提供されました。 ヒドロキシルラジカルによる物質の酸化を阻止するNBの能力を測定するためにNBを使用した場合、顕著なサイズ依存性が観察されました。 超小型NBは広範な基質に対して強力な抗酸化効果を示すが、通常のNBは一部の基質に対してのみ機能することが判明した。 超小型NBの気体と水の界面は消耗品ではないため、その抗酸化作用は持続可能であり、その効果は累積的であると考えられます。 私たちは、この研究が還元剤の供給のないシステムで過剰なフリーラジカルを除去するための新しいソリューションの開発に役立つと信じています。

実験はまず、ヒドロキシルラジカルによって引き起こされる3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）の酸化をブロックする能力を検出することにより、極小窒素（N2）NBの抗酸化効果を測定することによって行われました（図） S1 および S2) は、Cu2+ の触媒作用により H2O2 から生成されます。 超小型の N2 NB は圧縮・減圧プロセス中に冷純水 (0 °C) 中で生成され 37、室温および大気圧下で酸化反応系に導入されました。 酸化曲線は、TMB38 の酸化生成物の 652 nm での吸光度をモニターすることによって得られました。 N2 NB自体は652 nmで検出可能な吸光度を持たず（図S3）、N2 NB含有水の酸化還元電位は純水の酸化還元電位と同様であったことは注目に値します（表S1）。 結果は、超小型の N2 NB を含む水中での TMB の酸化速度は、反応時間の増加とともに純水中の酸化速度と比較して大幅に低下し、プラトーでの吸光度の値は純水中のものよりもはるかに低いことを示しました。図 1a)、超小型 N2 NB の強力な抗酸化効果を示唆しています。 さらに、比較研究により、超小型N2 NBの抗酸化能力は、100～200μMの濃度で一般的な抗酸化剤であるアスコルビン酸ナトリウムと同等であることが示されました（図1b）。

超小型N2 NBの酸化防止。 (a) 超小型 N2 NB を含む水中での TMB の酸化曲線。 (b) 超小型 N2 NB とさまざまな濃度のアスコルビン酸ナトリウムの相対酸化物価の比較。 まず、さまざまな濃度のアスコルビン酸ナトリウムを含む水中でのTMBの酸化曲線を(a)のように測定しました。 そして、各酸化曲線から最大吸収値を求めた。 各項目の相対酸化物値は次のように計算されました: \(相対酸化物\;値\;\left( {item} \right) = \frac{{Max\;absorbance\;\left( {item} \right)} }{{最大\;吸光度\;\left( {なし\;NBs} \right)}}\)。 (c) NTA (上) および DLS (下) によって測定された NB サイズ分布。 円は、約 50 nm のサイズの NB のピークを強調表示します。 (d) 脱気前後の極小 N2 NB 含有水中での TMB の酸化曲線。

私たちの実験では、水中のナノバブルのサイズ分布と濃度を決定するための補完的な手段として、ナノ粒子追跡分析 (NTA) と動的光散乱 (DLS) が採用されました 39。 比較的少数の個々の物体のブラウン運動を監視することにより、NTA は多分散集団の濃度 (106 ～ 109 粒子/mL) とサイズ (10 ～ 2000 nm) を正確に測定できます40。 水中での NB の光散乱は低いため、NTA は濃度を測定しながら 50 ～ 2000 nm の範囲でサイズ分布をテストできます。 DLS の場合、より多数のオブジェクトの集団拡散が監視され、それらの平均サイズが計算されます。 ただし、DLS は、濃度情報なしで、0.3 nm ～ 15 μm の範囲のサンプルの大まかなサイズ分布のみを提供します 41,42。 図 1c (上) は、NTA によって測定された、生成されたままの N2 NB の典型的なサイズ分布を示しており、ピークは主に 50 ～ 270 nm の間にあります。 NTA 分析では、NB 濃度が 5.42 × 107 ± 5.78 × 106 粒子/ml、平均 NB サイズが 152.7 ± 14.1 nm であることも示されました。 図 1c (下) は、DLS 曲線に非常に強い散乱強度を持つ 2 つのピークを示し、サイズのほとんどがそれぞれ 3.62 nm と 255 nm に集中していることを示しています。 DLS 数パーセント曲線 (図 1c、下) で観察された唯一のピークは 3.62 nm を中心とし、これらの極小 NB が溶液中の数の圧倒的多数を占めていることを示唆しています。

NB生成中の不純物の導入が観察された抗酸化効果を引き起こした可能性を排除するために、脱気実験が行われました。 0.01気圧の真空下で24時間脱気した後、水中のN2 NBの大部分を除去することにより（図S4）、TMB酸化曲線（図1d）は、N2 NB水の抗酸化能力が大幅に低下することを示し、これを明確に確認しました。観察された抗酸化効果は不純物によるものではなく、N2 NB に由来するものであることがわかりました。

生成されたN2 NBのサイズは0〜300 nmの範囲に広く分布していたので（図1c）、それらの抗酸化能力にサイズ依存性があるかどうかを調査することは妥当でした。 室温で新鮮な超純水中で生成された通常のN2 NBは、TMBの酸化を阻害しませんが、わずかに促進することがわかりました（図2a）。 NTA 研究では、70 ～ 220 nm の正常な N2 NB の典型的なサイズ分布（図 2b、上）、NB 濃度が 6.41 × 107 ± 1.72 × 107 粒子/ml、平均 NB サイズが 116.9 ± 14.7 nm であることが示されました。 。 DLS 研究により、それぞれ 142 および 396 nm を中心とする 2 つの強い散乱強度ピークが明らかになりました (図 2b、下)。 正常な N2 NB の NTA と DLS の結果では、どちらも 50 nm 未満のサイズの NB は検出されず、抗酸化効果は超小型 NB (通常 < 50 nm) によってのみ引き起こされることが示唆されました。 さらに、通常のN2 NBから凍結融解操作によって変化した超小型N2 NBも抗酸化作用を示すことがわかりました（図S5）。 超小型の N2 NB に加えて、超小型の酸素 (O2) NB も TMB 酸化反応において強力な抗酸化作用を持っています (図 S6)。

通常の N2 NB による TMB の酸化。 (a) 通常の N2 NB を含む水中での TMB の酸化曲線。 (b) NTA (上) および DLS (下) によって測定された正常な N2 NB のサイズ分布曲線。

上記の結果は、NB の抗酸化能力にサイズ依存性があることを明らかに示しました。 超小型の N2 NB はヒドロキシルラジカルによる TMB の酸化を阻害しますが、そのクラスターまたは通常の N2 NB (通常 > 50 nm) は TMB の酸化をわずかに促進します。 TMB 酸化に対する小さい NB と大きい NB の対照的な効果を理解するのは難しいようです。 現在、NB の界面の化学的性質に関する知識は非常に乏しいため、ガスと水の界面による酸化と還元の制御に関する既存の認識に基づいて観察を解釈することが賢明です。 NB の表面電位差は通常 -20 mV であるため、小さな水滴の気液界面の 3 V よりもはるかに小さくなります 28,43。 したがって、Nam と Richard が提案した表面電界メカニズムから得た結果を説明するのは適切ではありません。 以前の研究では、フリーラジカルと基質の両方が気液界面で濃縮されると、酸化反応が加速される可能性があることが示されています 26,44。 したがって、NB の気液界面における ROS の選択的濃縮が反応システムにおいて重要な役割を果たしている可能性があると考えられました。 もっともらしい説明は、超小型NBの表面積が非常に小さく、より大きな基質分子が容易に吸着するには十分なスペースがなかったため、より多くのROSを濃縮する一方で基質分子はより少なくすることを優先したという事実である可能性があります。 寿命の短いヒドロキシルラジカルは界面で濃縮され、それ自体で消光されると考えられます (図 3)。 対照的に、大きなNB（またはNBクラスター）の大きな表面積は、気液界面でTMBとヒドロキシルラジカルの両方を濃縮し、通常のようにTMBとヒドロキシルラジカルの間の反応を強化します。 このメカニズムは、別の古典的なヒドロキシルラジカルプローブである2,2'-アジノビス-(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホネート)（ABTS）でも機能します（図S7）。 ヒドロキシルラジカルに加えて、超小型NBもスーパーオキシドアニオンラジカルを捕捉することがわかりました（図S8）。

超小型NBの抗酸化メカニズム。

私たちが提案したメカニズム（図3）によれば、通常のNBは気液界面でROSと疎水性TMBを同時に吸着し、反応確率を高めるため酸化を促進します。 そうであれば、気液界面ではなく水相に留まりやすい基質分子を用いた場合には、通常のNBも抗酸化効果を発揮するはずである。 この仮説を検証するために、ヒドロキシル ラジカルを捕捉するために、一般的に使用される電子スピン共鳴 (ESR) スピン トラップであるジメチル ピリジン N-オキシド (DMPO) が使用されました。 DMPO は親水性であるため、水相に存在する必要があります。 この実験では、ESR を使用して酸化 DMPO (DMPO-OH) の強度を測定しました。 結果 (図 4) は、通常の N2 NB または超小型 N2 NB を含む反応系の DMPO-OH シグナルが対照群よりも大幅に低いことを示し、抗酸化効果を示しています。 この結果は、私たちのメカニズムをさらに裏付けています。

通常の N2 NB または超小型 N2 NB を含む水中の DMPO-OH シグナル強度の経時変化。

NBの抗酸化における反応系の関与の可能性を排除するために、紫外線（UV）放射45、46、47（図5aおよびS9）またはCu2+の代わりにFe2+（図S10）を使用して、H2O2からヒドロキシルラジカルを生成しました。 。 結果は、通常の N2 NB のわずかな酸化促進効果とは対照的に、超小型 N2 NB の強力な抗酸化効果も示しました。 したがって、還元剤を含まない NB の抗酸化効果は、主に超小型 NB 自体によるものであると考えられます。

紫外線によって生成されたヒドロキシルラジカルによる酸化されたTMBの吸光度。 (a) UV 照射後の 3 つの平行グループにおける酸化 TMB の吸光度。 (b) 3 時間の UV 照射後の超小型 N2 NB と 1 mM アスコルビン酸ナトリウムの抗酸化能力の減衰。

反応で消費される反応性ナノバブル 48,49 を含む従来の還元剤と比較して、超小型 NB の抗酸化剤としての使用には特定の利点があります。 まず、超小型 NB は純水中で安定であり 41、高レベルの ROS 環境下でも抗酸化能力を維持できます。 例えば、超小型のN2 NBは、水中のH2O2の強力なUV照射によって常に生成される高レベルのヒドロキシルラジカルを含む系において、その抗酸化能力のほぼ100％を維持しました（図5b）。 対照的に、1 mM アスコルビン酸ナトリウムは徐々に消費され、同じ条件下では元の抗酸化能力の約 0.1% しか維持されませんでした (図 5b)。 第二に、提案された抗酸化メカニズムによれば、超小型NBでROSをクエンチした後、有害な酸化生成物は残らないでしょう。 私たちは、このユニークな特性が、超小型NBを生体システムの抗酸化剤として応用する際に本質的に重要であると信じています。 高用量の外因性抗酸化物質や酸化生成物は、多くの場合、正常な細胞に有害です14,50。 第三に、超小型 NB は安定であり、持続的な抗酸化機能を持つことができますが、多くの抗酸化物質は環境の影響を受けやすく、保管や輸送中に劣化してしまいます。 原則として、超小型NBは寿命の短いROSを除去するのにのみ効果的ですが、寿命の長いフリーラジカルを除去するのは難しいことに注意してください。 幸いなことに、生物内で生成される有害なラジカルのほとんどは寿命の短い ROS です。

要約すると、超小型 NB の抗酸化効果が研究されています。 我々の結果は、極小NBがヒドロキシルラジカルによって引き起こされる疎水性基質（TMB）または親水性基質（DMPO）の酸化を阻害する明らかな効果があることを示しました。 反応系に特別な化学還元剤が添加されていないため、超小型NBの抗酸化能力は生体システムで安全に使用でき、人間を含む生物の酸化ストレスの緩和に応用できる可能性があります。 さらに、NB は自然界に遍在して存在すると考えられているため、我々の結果は、一部の天然水または「機能性」水の健康効果が主張されているという物議を醸している問題に対して、新たな科学的見解を提供する可能性もあります51。 多くの実際の用途における抗酸化要求に適合するように、より高濃度でサイズ分布をより正確に制御して超小型 NB を調製する技術の開発において、さらなる探求が行われる必要があります。

超純水は、ELGA LabWater (ELGA Classic-PURELAB) 機器から調製されました。 塩化銅(II)二水和物(分析グレード、≧99%、Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd)および3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(分析グレード、≧99%、Macklin試薬); 2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩 (≥ 98%、OKA); 硫酸鉄(II)七水和物 (分析グレード、≥ 99%、Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd); 1,2,3-トリヒドロキシベンゼン (分析グレード、Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd); 過酸化水素 30% 水溶液 (保証グレード、Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd); 5,5-ジメチル-1-ピロリジン-N-オキシド (≥ 98%、SIAL); 窒素と酸素の純度は 99.999% 以上です。 これらの化学薬品は、さらに精製せずに受け取ったまま使用しました。

NB は、以前に報告されている超純水中での圧縮減圧法によって生成されました 37。 実験は、圧力制御を備えた特注の金属チャンバー内で実施されました。 まず、チャンバー内に超純水を入れ、圧力が０．６ＭＰａになるまでガス（Ｎ２またはＯ２）をチャンバー内に導入した。 次いで、チャンバー内の圧力をゆっくりと常圧（１ａｔｍ）まで減圧（２０ｓｃｃｍ）した。 NB は、氷と水の混合物から調製された室温または 0 °C の超純水中で生成されました。

ナノ粒子追跡分析 (NTA) システム (NS300、マルバーン、英国) を使用して、水中で調製された NB の数密度とサイズを分析しました。 NTA 3.4 ソフトウェアを使用してデータをキャプチャし、分析しました。 さらに、動的光散乱 (DLS、nano-ZS90、Malvern) 装置も散乱光の強度と NB の数 (%) を検出するために使用されました。

N2 NB の抗酸化効果は、Cu2+ (10 μM) の触媒作用により H2O2 (最終濃度 0.8 M) から生成されるヒドロキシルラジカルによる TMB (最終濃度 0.4 mM) の酸化をブロックする能力によって決定されました。 TMB の酸化速度論に対する NB の影響は、652 nm での吸光度をモニタリングすることによって決定されました。 超純水/NBs水を加えて最終反応量を1mlに設定しました。 反応混合物を調製した後、それらを直ちに96ウェルプレートに移した(各サンプルは4ウェルに200μL)。 マイクロプレートリーダー (VERSA max マイクロプレートリーダー) を使用して、652 nm での光学密度の変化を監視しました。

Fe2+/H2O2系における通常のN2 NBまたは超小型N2 NBの下でのTMBの酸化曲線。 Fe2+、TMB、および H2O2 の最終濃度は、それぞれ 50 μM、0.4 mM、および 80 mM でした。 超純水/NBs 水を加えて最終反応量を 1 ml に設定しました。 反応混合物を調製した後、それらを直ちに96ウェルプレートに移した(各サンプルは4ウェルに200μL)。 マイクロプレートリーダー (VERSA max マイクロプレートリーダー) を使用して、652 nm での光学密度の変化を監視しました。

N2 NB の抗酸化効果は、Cu2+ (10 μM) の触媒作用により H2O2 (最終濃度 0.8 M) から生成されるヒドロキシルラジカルによる ABTS (最終濃度 200 μg/mL) の酸化をブロックする能力によって決定されました。 ）。 ABTS の酸化速度論に対する N2 NB の影響は、405 nm での吸光度をモニタリングすることによって決定されました。 超純水/NBs水を加えて最終反応量を1mlに設定しました。 反応混合物を調製した後、それらを直ちに96ウェルプレートに移した(各サンプルは4ウェルに200μL)。 マイクロプレートリーダー (VERSA max マイクロプレートリーダー) を使用して、405 nm での光学密度の変化を監視しました。

アルカリ条件下では、ピロガロールは急速に自動酸化して O2-・ を放出し、325 nm の波長で強い光吸収を有する着色中間生成物を生成します。 O2-・をクエンチできる物質が存在すると、中間生成物の蓄積が防止される。 ピロガロールの最終濃度は 0.1 mM、緩衝系は pH 8.0 の Tris-HCl 緩衝液でした。 反応混合物を調製した後、それらを直ちに96ウェルプレートに移した(各サンプルは4ウェルに200μL)。 マイクロプレートリーダー（VERSA max マイクロプレートリーダー）を使用して、325 nm での光学濃度の変化を監視しました。

ESR測定のために、液体サンプルをキャピラリーチューブに吸引し、密封しました。 測定パラメータは次のとおりです。 セントラ磁場: 324 mT。 スイープ幅: 5.0 × 1 mT; 変調周波数: 100.00 kHz; モッド。 幅+/−：0.35×1mT; 掃引時間: 1 分 ESR Data Process ソフトウェアを使用してデータを分析しました。

石英キュベット（1 × 1 × 5 cm3）に入れた TMB（0.4 mM）と H2O2（0.08 M）を含む反応溶液（2 ml）を UV ランプ（20 W）から 30 cm 離れたところに置き、ある波長で照射しました。 256nmで10分間。 652 nm の波長における溶液の吸光度値は、放射線照射の終了時に測定されました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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ナノバブルの抗酸化メカニズムについて有益な議論をしていただいた、シンガポールの南洋理工大学の Changqing Sun 教授に感謝いたします。 この研究は、中国国家自然科学財団 (番号 11975297、12274427、11874379、22109169、12104469、12005284)、フロンティア科学重点研究プログラム、CAS (番号 QYZDJ-SSW-SLH019)、および上海国際財団の支援を受けました。科学技術協力プログラム (22490714400)。

これらの著者、Jin Zheng と Juncheng Qi も同様に貢献しました。

CAS Key Laboratory of Interfacial Physics and Technology、上海応用物理研究所、中国科学院、上海、201800、中国

Jin Zheng、Juncheng Qi、Kaiwei Yuan、Lijuan Zhang、Hongwei Zhao、Junhong Lü、Beien Zhu、Yi Zhang、Jun Hu

中国科学院上海先進研究所、上海、201203、中国

Lijuan Zhang、Hongwei Zhao、Junhong Lü、Beien Zhu、Yi Zhang、Jun Hu

中国科学院大学、北京、100049、中国

ジン・ジェン、ジュンチェン・チー、カイウェイ・ユアン

中国科学院温州研究所、温州、325000、浙江省、中国

サンジャオ・ソング

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概念化：HJ、ZY 方法論：ZJ、QJ、SS、YK 調査：ZL、ZH、LJ 視覚化：ZY、ZJ 監督：HJ、ZY、SS、ZB 執筆 - 原案：ZJ、QJ 執筆 - レビューおよび編集：ZY 、HJ

Yi Zhang または Jun Hu への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Zheng, J.、Qi, J.、Song, S. 他外因性抗酸化物質を使用しない超小型ナノバブルに基づく抗酸化戦略。 Sci Rep 13、8455 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35766-5

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受信日: 2023 年 3 月 6 日

受理日: 2023 年 5 月 23 日

公開日: 2023 年 5 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35766-5

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